Jest to nowy typ pokoju wyzwań dodany w Wrath of the Lamb. Od zwykłego pokoju wyzwań odróżnia
go krwawy miecz na minimapie (o ile nie mamy klątwy ciemności) i czaszka ze skrzyżowanymi mieczami znajdująca się nad drzwiami na planszy.
Boss Challenge Room jest o tyle trudniejszy, że dostęp do niego mamy tylko mając jedno stałe serce, lub mniej (Serca Dusz się nie liczą). znajduje się w nim losowy przedmiot, wypadający z bosów, którego podniesienie skutkuje koniecznością walki z dwoma lub trzema bossami jeden po drugim (będą dopasowani do poziomu, w którym gracz się znajduje, więc np. jeżeli jesteśmy na Basement/Cellar, gra da nam Monstro, następnie 3 małe Larry Jr. do walki). Można się też dostać do niego przez Secret Room (o ile sąsiaduje on z tym pokojem), wtedy ilość serc nie ma większego znaczenia i łatwiej jest wygrać walkę (ewentualnie można wymknąć się przez Secret Room, lecz jest to możliwe tylko przez posiadanie przedmiotu Xray Vision).